牛初乳粉中IgG蛋白的分離純化及檢測方法

（1）牛初乳樣品預(yù)處理

① 去除脂肪及酪蛋白：

A. 取3g牛初乳粉溶于20mM PB中，漩渦震蕩混勻充分溶解，定容至30mL ，濃度為1g/mL。

（可滴加少許消泡劑，約4μL/mL）

B.用6M HCl調(diào)pH至4.5，37℃ 水浴35min，9000r/min 離心20min，棄沉淀，保留上清。

② 去β-乳球蛋白：

將上述上清用10M NaOH回調(diào)pH至7.0，9000r/min 離心20min，棄沉淀，保留上清。

③ 去除小分子雜蛋白及脫鹽濃縮樣品：

將上述上清倒入30kDa超濾管中，8000r/min 離心10min，收集截留液。

④ 除微生物雜質(zhì)：

將截留液過0.45μm濾膜，準(zhǔn)備上樣。

（2）Protein G 4FF親和純化（280nm）

（3）SDS-PAGE電泳測定純度

① 10×電泳緩沖液配置（1L）：

② 上樣：

按4:1=樣品：5×Loading Buffer 的比例加入上樣緩沖液混勻，沸水浴5-10min，據(jù)樣品情況選擇上樣量，Marker 5μL/孔，濃縮膠80V 20min，分離膠120V 60min電泳。

③ 染色及脫色：

用染色液染色30min，用蒸餾水清洗后，查看結(jié)果。

（4）BC-10重力柱脫鹽（8.3mL）

液相色譜檢測

①超濾濃縮 → ②-20℃預(yù)凍干 → ③-80℃真空凍干 → ④凍干樣品復(fù)溶純度色譜檢測 → 蛋白凍干-20密封保存。

采用月旭Welchrom^® PreCot Protein G 4FF（5mL，00081-12012）與月旭Welchrom^® BC-10重力柱（8.3mL，00051-32022）兩種層析柱進行二次層析，可以使樣品純度達到97%，再經(jīng)30kD超濾管進行濃縮可進一步提升樣品純度，經(jīng)月旭Xtimate^® SEC-300（7.8×300mm，5μm）色譜檢測純度達到99.86%。